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閱讀次數(shù)：1434 發(fā)布時(shí)間：2012/9/19 8:33:45
一、組織抽提：1. 取組織塊50-100㎎用液氮在研缽中研磨成粉末2. 移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol 抽打勻漿3. 移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打4. 冰上孵育5分鐘5. 離心12,000g 4℃ 5分鐘取上清液移入1.5ml新離心管6. 加0.2 ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘7. 離心<12,000g 4℃ 10分鐘取上層液相移入1.5ml新離心管8. 加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘9. 離心<12,000g 4℃ 5分鐘棄去上清液10. 加入1 ml 75%乙醇，震蕩11. 離心<7,500g 4℃ 5分鐘棄去上清液12. 室溫下使之變透明13. 加入DEPC處理水10μl －－35μl 溶解RNA（可保存在液氮或低溫冰箱）14. 走RNA變性電泳觀察18s，28s條帶，分光光度計(jì)檢測(cè)260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度 二、RT反應(yīng)體系（步）：約20分鐘
RNA 抽提物 5μl Radome引物 2μl RNA sin 0.5μl
| RNA sin | 0.5μl |
| 10mM dNTP | 1μl |
| 5×RT 緩沖液 | 4μl |
| 25mM MgCl2 | 4μl |
| AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 | 3μl |
| 25mM MgCl2 | 2μl |
| 10×PCR 緩沖液 | 5μl |
| 10mM dNTP | 1μl |
| 上下游引物10pmol/μl | 2.5μl×2 |
| CDNA模板 | 2.5μl |
| ddH2O | 34μl |
| Taq酶 | 0.5μl |
| 輕質(zhì)石蠟油 | 50μl |
| | 100μl |
| 25mM MgCl2 | 3μl |
| 10×PCR 緩沖液 | 5μl |
| 10mM dNTP | 1μl |
| 上下游引物10pmol/μl | 2.5μl×2 |
| CDNA模板 | 5μl |
| ddH2O | 30μl |
| Taq酶 | 1μl |
| 輕質(zhì)石蠟油 | 50μl |
| | 100μl |
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